488/555/594/640/Cy3 TUNEL 细胞凋亡试剂盒产品说明书
488/555/594/640/Cy3 TUNEL 细胞凋亡试剂盒
产品货号 :XK6014S
产品内容：
组分
规格
20T 50T
A. TUNEL Equilibration Buffer 2×1 mL 5 mL
B. YF®488/555/594/640/Cy3 TUNEL Reaction Buffer 1 mL 2 × 1.25 mL
C. TdT Enzyme 20 μL 50 μL
D. Proteinase K (2 mg/mL) 40 μL 100 μL
E. DNase I (2 U/μL) 5 μL 13 μL
F. 10 × DNase I Buffer 100 μL 260 μL
储存条件
本产品应置于-20℃储存，组分B 需避光，避免反复冻
融。有效期见外包装。注：组分 A和 B 使用时请佩戴口罩、
手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
产品介绍
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这种
降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段为
180 bp-200 bp的整数倍， 表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异
的梯状 Ladder 图谱。本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端
脱 氧 核 糖 核 苷 酸 转 移 酶 （ Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase, TdT）在凋亡细胞中断裂 DNA 的 3′-OH 末端催2 / 3
生物荧光试剂
本产品仅用于科研
化掺入 YF®/Cy-dUTP， YF®/Cy-dUTP 标记的 DNA 可以用荧
光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以
选择性的检测凋亡细胞， 而非坏死细胞或因辐照和药物
而造成的 DNA 链断裂的细胞。标记的 dUTP（如地-高辛
-dUTP、生物素-dUTP），可以直接进行原位检测，是一种
更快速、直接的检测手段。
使用方法
实验材料（自备）
? PBS缓冲液（pH~7.4）
? 4%多聚甲醛（PBS配制）
? 牛血清白蛋白（BSA）或正常的羊、牛血清
? 70%乙醇（自选）
? 脱蜡溶剂（石蜡切片样本）
实验步骤
1. 样本准备：
（1）细胞样品
a. 可选： 准备一份阴性对照样本 （加入不含TdT酶的TUNEL
反应液）。
b. PBS 清洗细胞两次。
c. 细胞固定： 加适量4%多聚甲醛 （pH 7.4） ， 4℃放置 30 min，
d. PBS 清洗细胞两次。
e. 通透细胞：细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100
溶液通透，室温放置 20 min。
f. PBS清洗细胞两次。
（2）石蜡组织切片
a. 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2次，每次 5 min，以
脱掉石蜡。
注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。
b. 室温下， 将样本浸没于无水乙醇中漂洗 2次， 每次 5 min。
c. 室温下，将切片样本连续依次浸没在不同浓度梯度的乙
醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，
每次 5 min。
d. 室温下，将切片浸没于纯水中漂洗 3 min，再将切片浸没
于1×PBS中漂洗3 min， 用滤纸小心吸干切片样本周围液体。
e. 用免疫组化笔描绘样本轮廓，以便下游通透与标记。
f. 按 1: 100的比例， 将 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS
稀释至终浓度 20 μg/mL，在每个样本上滴加 100 μL，使溶
液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（蛋白酶 K 的孵
育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果，
但延长孵育时间可能导致切片脱落。 一般情况下， 厚度 4 μm
孵育 10 min，厚度 30 μm孵育 30 min。
g. PBS浸润清洗切片 2 次，每次5 min，用滤纸吸去多余的
液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后
续的标记反应。
（3）冰冻组织切片
a. 将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。
b. 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液中，室温固定 30 min。
c. PBS浸润清洗切片 2次，每次 5 min。
d. 用滤纸小心吸干切片样本周围液体。
e. 按1: 100的比例， 将 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS
稀释至终浓度 20 μg/mL，在每个样本上滴加 100 μL，使溶
液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（蛋白酶 K 的孵
育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果，
但延长孵育时间可能导致切片脱落。 一般情况下， 厚度 4 μm
孵育 10 min，厚度 30 μm孵育 30 min。
f. PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的
液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
（4）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进
行 TUNEL反应步骤）
a. 按1: 10的比例用ddH2O将10× DNase I Buffer稀释成1×
DNase I Buffer 备用。
b. 滴加 100 μL 1× DNase I Buffer 到已通透的样本上，覆盖
全部样本区域，室温平衡 5 min。
c. 用 1× DNase I Buffer 以 1: 100稀释 DNase I (2 U/μL)至终3 / 3
生物荧光试剂
本产品仅用于科研
浓度 20 U/mL的工作液。
d. 轻轻吸掉多余液体，加入 100 μL 浓度为 20 U/mL 的
DNase I 工作液，室温孵育10 min。
e. 轻轻吸掉多余液体，PBS清洗样品 2次。
2. TUNEL 反应
（1）每个样本加入 100 μL TUNEL Equilibration Buffer，室
温孵育 5 min。
（2）预先配制 TUNEL 反应混合液：每 50 μL TUNEL
Reaction Buffer 中加入 1 μL TdT 酶。
（3）弃去 TUNEL Equilibration Buffer，每个样本加入 50 μL
TUNEL 反应混合液。
a. 贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光
孵育 60 min。
b. 悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵
育或每隔 15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃
避光孵育 60 min。
c. 组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平
放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2 h（湿盒底部铺一张含少量
水的纸巾保持湿度）。
（4）去掉反应液，在 1× PBS 的染色缸中浸泡润洗2 次，每
次 5 min。再使用适量配制于 PBS中的 0.1% Triton X-100，
其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3次，每次 5 min，
以降低背景。
（5）（可选）复染：每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的DAPI
染液，室温避光孵育 10 min。染色完成后，去掉染液，并将
样本在 1× PBS中浸泡润洗 3次，每次 5 min。
（6）（可选）石蜡切片封片：将切片依次在纯水、70%乙
醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中浸没 5 min，
将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡， 透明化
处理 2次，每次 5 min。脱水完成后，擦去切片周围的液体，
每个样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊
子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。
（7）用荧光显微镜或流式细胞仪观察。（凋亡细胞应被标
记上明亮的荧光，没有加入 TdT 酶的阴性对照样本不能被
标记上荧光）。
注意事项
1. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注
意避光，以减缓荧光淬灭。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
488/555/594/640/Cy3 TUNEL 细胞凋亡试剂盒
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