647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）产品说明书
647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）
产品货号 :
XK6046S
产品内容：
组分 规格 20T 100T 500T 1000T 开封后保存温度 稳定性
A. 10 mM EdU 40 μL 200 μL 1 mL 2× 1 mL -20℃
开封后按指-定
温度保存可有
效放置一年
B. YF® 488/555/594/647A Azide 10 μL 50 μL 250 μL 500 μL -20℃，避光
C. 10× Click-iT EdU 反应缓冲液 200 μL 1 mL 5 mL 10 mL 2-8℃
D. CuSO4 100 μL 500 μL 2× 1.25 mL 5 mL 2-8℃
E. Click-iT EdU 缓冲液添加物 6 mg 30 mg 150 mg 2 × 150 mg 2-8℃
F. Hoechst 33342 5 μL 25 μL 125 μL 250 μL 2-8℃
规格：上述反应次数针对 96孔板培养的细胞，不同容器的具体用量可参考附表 1。
荧光光谱数据：YF® 488 Azide：495/519 nm；YF® 555 Azide：555/565 nm；YF®594 Azide：590/617 nm
647AAzide：650/670 nm；Hoechst 33342：350/461 nm（bound to DNA）
储存条件
-20℃避光保存，有效期见外包装。开封后，保存温度详见
说明书。

产品介绍
细胞增殖检测是评估细胞健康程度、 遗传毒性及抗肿瘤
药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最 的方法是
BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU
（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成
期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应，一种由铜
催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应，形成共价键。
本试剂盒中，EdU含有炔烃，YF® 488/555/594/647A
Azide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有
效，易于使用。BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变
性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结
合；而EdU法只需标准化的多聚甲醛固定和Triton X-100促
渗就可以使检测试剂进入细胞， 只需少量的叠氮化染料即可
非常有效地标记出整合的EdU。
本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于
体外培养细胞的增殖检测。
使用方法
实验材料（自备）
? 10 mM PBS, pH 7.2-7.6
? 4 %多聚甲醛固定液（in PBS）
? 促渗试剂（0.5 %Triton X-100 in PBS）
? 2 mg/mL 甘氨酸溶液（in ddH2O）
? 3 %BSA in PBS, pH 7.2-7.6
? 1 % BSA in PBS, pH 7.4
? ddH2O
荧光显微镜检测方法
1. 细胞培养
取对数生长期细胞，以每孔4×103
-1×105
细胞（可根据细胞
大小、 生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密
度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。
2. 药物处理
客户可以根据实验需要进行各种药物处理。
3. EdU标记
（1） 用细胞完全培养基按一定比例稀释EdU溶液 （组分A） ，
制备适量EdU培养基；
注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10
μM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU浓度梯
度，可参考附表 2和附表 3。
（2）细胞培养箱中孵育一段时间。
注：EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2 h）宜采用
高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（>24 h）宜采用低浓
度，如：1~10 μM；也可参考附表 3。
4. 细胞固定及促渗
（1）孵育完成后，去除培养基。加入50 μL 4 % 多聚甲醛
固定液，室温孵育15-30 min后，去除固定液。
（2）每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，
中和残留的固定液。
（3）以每孔100 μL 3 % BSA洗涤细胞2次。
（4）去除洗涤液，加入100 μL 0.5 % Triton X-100，室温孵
育20 min。
（5） 去除促渗剂， 每孔100 μL的 3% BSA 洗涤液洗涤 2次。
5. EdU检测
注：本参考步骤每个样本使用100 μL的工作液，用户可以根
据自己的样本情况调整用量。
（1）配置1× Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：用ddH2O
将组分C稀释10倍。
（2）配置5× Click-iT EdU缓冲液添加物 （组分E） ： 加300 μL
的ddH2O至30 mg的E组分管中（终浓度100 mg/mL），混匀
至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃，可保存一年，
溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。
注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解，制备成
5× 储液备用。
（3）准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：用ddH2O稀释5×
Click-iT EdU缓冲液添加物至1×，溶液应现配现用。
（4）依据表 1准备 Click-iT工作液。
表 1: Click-iT 工作液
反应组分 以 10个孔的
样本数为例
1× Click-iT EdU 反应缓冲液 855 μL
CuSO4 （组分 D） 40 μL
YF® 488/555/594/647AAzide（组分 B） 5 μL
1× Click-iT EdU缓冲液添加物 100 μL
总体积 1 mL
（5）每孔加入 100 μL Click-iT工作液，均匀覆盖细胞。
（6）室温避光孵育 30 min。
（7）除去 Click-iT 工作液，以 100 μL 3% BSA 洗涤细胞 2
次后， 去除洗涤液。 如其他无特别要求， 即可进行拍照分析。
6. DNA 复染（可选）
（1）用 100 μL PBS洗涤细胞1 次，去除洗涤液。
（2）用 PBS将 Hoechst 33342（组分F）稀释 2000倍。
（3）每孔加 100 μL 1× Hoechst 33342溶液，室温避光孵育
15-30 min。
（4）去除 Hoechst 33342 溶液，用 100 μL PBS 洗涤细胞 2
次。
7. 成像及分析
流式细胞仪检测方法
1. 细胞培养
取对数生长期细胞，以每孔4×103
-1×105
细胞（可根据细胞
大小、 生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密
度）接种于 96孔板中，培养至正常生长阶段。
2. 药物处理
客户可以根据实验需要进行各种药物处理。
3. EdU 标记细胞
（1）培养基稀释 10 mM EdU至合适浓度， 阴性对照组不用
EdU处理。
注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10
μM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯
度，可参考附表 2和附表 3。
（2）细胞培养箱中孵育一段时间。EdU孵育细胞的时间可
以直接用作测定细胞 DNA 合成的指标，时间点选择以及孵
育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行
的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。
注：EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2 h）宜采用
高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（>24 h）宜采用低浓
度，如：1~10 μM；也可参考附表 3。
4. 细胞固定及促渗
注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成
EdU 孵育后，以含 1 % BSA 洗涤细胞 2 次，在细胞固定促
渗之前进行。
（1）孵育完成后，收集细胞，1 % BSA清洗细胞1次，离心
收集细胞。
（2）100 μL 4 % 多聚甲醛重悬细胞。
（3）室温避光孵育 15 min。
（4）1 % BSA 洗涤细胞 2次。
（5）100 μL 0.5 % Triton X-100促渗液重悬细胞，室温孵育
20 min。
5. EdU 检测
注：针对96孔板样本可参考每孔100 μL 的工作液来进行，
用户可以根据自己的样本情况调整用量。
（3）配置1× Click-iT EdU反应缓冲液：用ddH2O将组分C稀
释10倍。
（4）配置 5× Click-iT EdU缓冲液添加物 （组分 E） ： 加 300
μL ddH2O 至 30 mg 的组分 E试管中（终浓度 100 mg/mL），
混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃，可保存
一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。
注： 不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解为5× 储
液备用。
（3）准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以ddH2O稀释5×
Click-iT EdU缓冲液添加物储液至1×，溶液应现配现用。
（4）依据表 2准备 Click-iT工作液。
反应组分 单次反应所需
加液体积
1× Click-iT EdU 反应缓冲液 875 μL
CuSO4 （组分 D） 20 μL
YF® 488/555/594/647A Azide（组分
B）
5 μL
1× Click-iT EdU 缓冲液添加物 100 μL
总体积 1 mL
（5）每管加入 1 mL Click-iT 工作液，混匀。
（6）室温避光孵育 30 min。
（7）1% BSA洗涤细胞 1 次，收集细胞，用 1 mL 1 % BSA
再次重悬细胞 （重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以
调整），流式细胞仪检测。
注：如需进行其他标志物检测可参考步骤4。
6. 细胞内抗原标记（可选步骤）
（1）加入抗体工作液，混匀。
（2）避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。
7. DNA 含量计算（可选步骤）
（1）如有需要，可加入适量 RNase 至每管，混匀。
（2）每管加入适量 DNA 染色液，避光孵育 10-15 min。
（3）上机待检。
附录：
附表 1.EdU 培养基及染色反应液的参考使用量
96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5 cm小皿
EdU培养基 100 μL 150 μL 200 μL 500 μL 1 mL 2 mL
染色反应液 100 μL 150 μL 200 μL 500 μL 1 mL 2 mL
附表 2. EdU 的参考孵育时间
细胞系 人胚胎细胞 酵母细胞 鼠成纤维细胞 人宫-颈癌细胞 人胚肾细胞系 人神经细胞
细胞周期 ~30 min ~3 h ~18 h ~21 h ~25 h ~5 d
孵育时间 5 min 20 min 2 h 2 h 2 h 1 d
注：（1）EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的 1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用 2 h孵育时间；
（2）考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化。
附表 3. 文献中EdU 孵育浓度及时间
PubMed ID Reference Cell Line Concentration Time
18272492 Salic A,et al.PNAS.2008 NIH3T3,Hela 10 nM~10 μM 1 h
18521918 Cappella P, et al. Cytometry A.2008 HL-60,A2780,U2OS 1~10 μM 0.5 h
18996411 Chehehasa F, et al.Neurosci Methods.2009 Neurospheres 1~20 μM 24 h
19179371 Limsirichaikul S, et al.Nucleic Acids Res.2009 Primary fibroblasts 10 μM 1,2,4 h
19253396 Warren M, et al. Dev Dyn.2009 Chick embryos 10 μM~2 mM 4 h
19647746 Yu Y, et al. J Immunol Methods.2009 Spleen cells 50 μM 24 h
19544417 Momcilovic O, et al.Stem Cells.2009 Human ES cells 10 μM 0.5 h
20080700 Cinquin O, et al. PNAS.2010 emb-30 1 μM 12 h
20025889 HanW, et al. Life Sci.2009 VSMC 50 μM 2 h
20659708 Huang C, et al. J Genet Genomics.2010 ESC 50 μM 2 h
21310713 Hua H, et al. Nucleic Acids Res.2011 Fission yeaststrains 10 μM 3 h
20824490 Lv L, et al.Mol Cell Biochem.2011 EJ cells 50 μM 4 h
21248284 Yang S, et al.Biol Reprod.2011 GC cells 50 μM 2 h
21227924 Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res.2011 U2OS, HT29 30 μM 1.5 h
21829621 Guo T, et al.PloS One. 2011 HIT-T15 50 μM 4 h
21980430 Zeng T, et al.PloS One. 2011 MCF-10A 25 μM 2 h
22012572 Ding D, et al.Int Orthop.2011 C3H10T1/2 10 μM 24 h
22000787 ZengW, et al. Biomaterials.2011 EPC 50 μM 4 h
21913215 Xue Z, et al. J Cell Biochem.2011 SGC7901 25 μM 24 h
22016038 Peng F, et al.Lasera Med Sci.2011 MSC 50 μM 2 h
21878637 Li D, et al. J Biol Chem.2011 HCC 50 μM 2 h
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