日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)

【产品名称】

商品名称：日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)

Name  ：Japanese Encephalitis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

日本乙型脑炎，又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）引起的一种人畜共患传染病。JEV主要是通过带病毒的蚊虫叮咬传播，而猪是JEV的主要增殖宿主和扩散宿主。JEV可引起妊娠母猪发生流产和死胎、公猪发生睾丸炎，新生仔猪发生脑炎、育肥猪持续高热，对养殖户造成巨大的经济损失。日本乙型脑炎广泛存在于 许多国家，严重威胁着人类的健康。

本试剂盒适用于检测的脑海马回部组织、全血等标本中日本乙型脑炎病毒RNA，适用于日本乙型脑炎病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用一对日本乙型脑炎病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对日本乙型脑炎病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

注：

1）  不同批号试剂不能混用。

2）  试剂盒内各试剂组分足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀动物的脑海马回部组织2g；待检活动物，抽取全血5ml

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100ul于1.5ml灭菌离心管中；全血样品待血凝后取血清100ul于1.5ml灭菌离心管中。

1.2 RNA提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

4.1    将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。

4.3    推荐循环参数设置：

5.结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道35值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值。

6.质控标准

阴性质控品：Ct>38或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

? 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

? 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

? 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

? 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

? 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

? 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

? 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

? 所有操作严格按照说明书进行；

? 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

? 反应液应避光保存；

? 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

? 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

? 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

? 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

? 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【注意事项】

[1] 殷震，刘景 华.动物病毒学[M].第2版.北京：科学出版社，1997,631~640.

[1] 金宁，胡仲明，冯书章等.人畜共患病学[M].北京：科学出版社，2007,243~262.